抗體的制備方法與原理 一、抗血清的制備 有了質(zhì)量好的抗原，還必須選擇適當(dāng)?shù)拿庖咄緩?，才能產(chǎn)生質(zhì)量好（特異性強和效價高）的抗體。 （一）用于免疫的動物 作免疫用的動物有哺乳類和禽類，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實驗室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動物反應(yīng)良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清，用于免疫的動物應(yīng)適齡，健壯，無感染性疾患，為///雄性，此外還需十分注意動物的飼養(yǎng)，以消除動物的個體差異以及在免疫過程中死亡的影響。若用兔，用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以2～3kg為宜。 ?。ǘ┟庖咄緩?/p> 免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或背部多點皮內(nèi)注射，每點注射0.1ml左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。 （三）佐劑 由于不同個體對同一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強有弱，因此常常在注射抗原的同時，加入能增強抗原的抗原性物質(zhì)，以刺激機體產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱為免疫佐劑。 佐劑除了延長抗原在體內(nèi)的存留時間，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，促進T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用，從而增強機體對抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生。 常用的佐劑是福氏佐劑（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調(diào)整為1：2～9（V/V），這是不*福氏佐劑，在每毫升不*佐劑加入1～20mg卡介苗就成為*佐劑。 配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4℃下保存?zhèn)溆?。免疫前取等容積*或不*佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，滴于冰水上5～10min內(nèi)*不擴散為止。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復(fù)抽吸，約數(shù)十分鐘后即能*乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。 （四）免疫方法 抗原劑量，劑量為300～500μg，加強免疫的劑量約為劑量為1/4左右。每2～3周加強免疫一次。加強免疫時用不*佐劑，免疫時皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加強免疫時不必注射百日咳疫苗。 在第2次加強免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3ml血，制備血清，檢測抗體效價（見后）。如未達(dá)到預(yù)期效價，需再進行加強免疫，直到滿意時為止（圖2-3）。當(dāng)抗體效價達(dá)到預(yù)期水平時，即可放血制備抗血清。 
圖2-3 抗體反應(yīng) （五）抗血清的采集與保存 家兔是zui常用以產(chǎn)生抗體的動物，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動物以頸靜脈、動脈取血，鼠等小動物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動脈放血，一是頸動脈入血，也可心臟采血。取動脈或靜脈放血時，將兔放入一個特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管擴張、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片，快速切開動脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血。頸動脈放血時，將兔仰臥，固定于兔臺，剪去頸部的毛，切開皮膚，暴露頸動脈，插管，放血。放血過程中要嚴(yán)格按無菌要求進行。 收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min。在無菌條件，吸出血清，分裝（0.05～0.2ml），貯于-40℃以下冰箱，或凍干后貯存于4。C冰箱保存。 ?。┛寡遒|(zhì)量的評價 在免疫期間，不僅各個不同的動物，而且同一動物在不同的時間內(nèi)抗血清效價、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測試。只有在對抗血清的效價、特異性、親合力等方面作*的評價后，才可使用所取得的抗血清。 1．效價 抗血清的效價，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價測定的方法常用的是放射免疫法，此法對所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴散等方法測定。前者測定的效價極為。而后者則粗糙得多。 ?。?）放射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與標(biāo)記抗原混合，孵育24h后，測定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度和為效價。如某抗血清的結(jié)合率為50%時的稀釋度為1：15000，則該血清的效價就是1：15000?？寡宓男r，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量、孵育時間，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意。（測定方法見第8章 ） ?。?）雙向擴散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。 球脂板的制備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂*溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65℃左右時，加入疊氮鈉（NaN3），使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，*凝固后，用打孔器打孔（圖2-4）。中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50μl），周圍各孔內(nèi)分別加入50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，觀察有無沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度（圖2-5）。 
圖2-4 雙向擴散模型 
圖2-5 免疫擴散試驗 2．特異性測定 抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識別能力。特異性好就是抗血清的識別能力強。通常，特異性是以交叉反應(yīng)率來表示的。交叉反應(yīng)率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。交叉反應(yīng)率一般是用競爭抑制曲線來判斷的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競爭抑制曲線，計算各自的結(jié)合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50時的濃度，按下列公式計算交叉反應(yīng)率。 S=y/Z×100% S：交叉反應(yīng)率，y：IC50時抗原濃度，Z：IC50時近似抗原物質(zhì)的濃度。 如某抗原的IC50濃度為90Pg/管，而一些近似抗原物質(zhì)IC50濃度幾乎是無限大，可以說這一抗血清與其它抗原物質(zhì)的交叉反應(yīng)率近似零，即無交叉反應(yīng)，該抗血清的特異性是好的。 3．親合力 在免疫學(xué)中， 親合力是指抗體與結(jié)合抗原體的活度或牢固度?？贵w與抗原結(jié)合疏松，結(jié)合后會迅速解離，稱為親合力低，反之，親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小，抗體分子的結(jié)合位點與抗原的決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度決定的。親合力常以親合常數(shù)K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）。在RIA中，K是該抗血清能達(dá)到的zui小檢出量（靈敏度）的倒數(shù)，K=1/[H]，[H]是zui小檢出量，通常，K的范圍在108～1012L/mol之間，也有高達(dá)1014L/mol的。 計算親合常數(shù)的方法20余種，計算出的K都不能真實反映實驗情況，只能作為參考。 ?。ㄆ撸┟庖呤〉目赡茉蚣皯?yīng)采取的措施 有時不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進之。 ?。?）免疫動物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動物的種屬或品系，或擴大免疫動物的數(shù)量。 ?。?）抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進提取方法。 （3）制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑，載體、抗原或載體的比例、反應(yīng)時間等多方面去考慮，并加以改進。 ?。?）所用的佐劑是否合適，乳化是否*，可改用其它佐劑，或加強乳化。 ?。?）免疫的方法、劑量，加強免疫的間隔時間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。 （6）動物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。 二、單克隆抗體的制備 1975年Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進行融合，形成的雜交瘤細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無性繁殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破使血清學(xué)的研究進入了一個高度的新紀(jì)元。 免疫細(xì)胞化學(xué)的 技術(shù)關(guān)鍵之一是制備特異性強、親合力大、滴度高的特異性抗體，由于每種抗原都有幾個抗原決定簇，用它免疫動物將產(chǎn)生對各個決定簇的抗體，即多克隆抗體。單克隆抗體則是由一個產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與一個骨髓瘤細(xì)胞融合而形成的雜交廇細(xì)胞經(jīng)無性繁殖而來的細(xì)胞群所產(chǎn)生的，所以它的免疫球蛋白屬同一類型，質(zhì)地純一，而且它是針對某一抗原決定簇的，因此特異性強，親合性也一致。單克隆抗體（McAb）的特性和常規(guī)血清抗體的特性比較見2-3。 表2—3 單克隆抗體（McAb）和常規(guī)免疫血清抗體的特性比較 | 項目 | 常規(guī)免疫血清抗體 | McAb | | 抗體產(chǎn)生細(xì)胞 | 多克隆性 | 單克隆性 | | 抗體的結(jié)合力 | 特異性識別多種抗原決定簇 | 特異性識別單一抗原決定簇 | | 免疫球蛋白類別及亞類 | 不均一性，質(zhì)地混雜 | 同一類屬，質(zhì)地純一 | | 特異性與親合力 | 批與批之間不同 | 特異性高，抗體均一 | | 有效抗體含量 | 0.01～0.1mg/ml（小鼠腹水） | 0.5～5.0mg/ml（小鼠腹水） 0.5～10.0μg/ml（培養(yǎng)物上清液） | | 用于常規(guī)免疫學(xué)實驗 | 可用 | 單抗組合應(yīng)用 | | 抗原抗體形成格子結(jié)構(gòu)（沉淀反應(yīng)） | 容易形成 | 一般難形成 | | 抗原抗體反應(yīng) | 抗體混雜，形成2分子反應(yīng)困難，不可逆 | 可形成2分子反應(yīng)，可逆 | 單克隆抗體的制備方法如下。 ?。ㄒ唬﹦游锏倪x擇與免疫 1．動物的選擇 純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實驗室均能飼養(yǎng)成活。目前開展雜交瘤技術(shù)的實驗室多選用純種BALA/C小鼠。 2．免疫方案 選擇合適的免疫方案對于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般在融合前兩個月左右根據(jù)確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。 ?。?）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏*佐劑、福氏不*佐劑。 初次免疫 抗原1～50μg加福氏*佐劑皮下多點注射或脾內(nèi)注射（一般0.8～1ml,0.2ml/點） ↓3周后 第二次免疫 劑量同上，加福氏不*佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過0.5ml） ↓3周后 第三次免疫 劑量同一，不加佐劑，ip（5～7天后采血測其效價） ↓2～3周 加強免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv（靜脈內(nèi)注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應(yīng)答水平，增強免疫細(xì)胞對抗原的反應(yīng)性。 ?。?）顆粒抗原免疫性強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細(xì)胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為1～2×107個細(xì)胞。 初次免疫 1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫 1×107/0.5ml ip ↓3周后 加強免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）細(xì)胞融合 1．細(xì)胞融合前準(zhǔn)備 ?。?）骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用的骨髓瘤細(xì)胞系見表2-4。 表2-4用于融合試驗的主要骨髓瘤細(xì)胞系 | 名 稱 | 來 源 | 耐 受 藥 物 | Ig鏈 | | H L | | P3/X63-Ag8（X63） | BALB/C骨髓瘤MOPC-21 | 8-氮鳥嘌呤 | r1 K | | P3/X63-Ag8.653（X63-Ag8.653） | P3/X63-Ag8 | 8-氮鳥嘌呤 | － － | | P3/NSI-1-Ag4-1（NS-1） | P3/X63-Ag8 | 8-氮鳥嘌呤 | － K（不分泌型） | | P3/X63-Ag8.Ul（P3Ul） | （X63×BALB/C脾細(xì)胞）雜交瘤 | 8-氮鳥嘌呤 | － － | | SP2/0-Ag14（SP2/0） | （X63×BALB/C脾細(xì)胞）雜交瘤 | 8-氮鳥嘌呤 | － － | | F0 | BALB/C骨髓瘤 | 8-氮鳥嘌呤 | － － | | S194/5.XXO.BU.1 | P3/X63-Ag8 | 5-溴脫氧尿嘧啶核苷 | － － | | MPC11-45.6TG1.7 | BALB/C骨髓瘤MPC-11 | 6-巰鳥嘌呤 | r2b K | | 210.RCY3.Ag1.2.3 | LOU大鼠骨髓瘤R210 | 8-氮鳥嘌呤 | － K | | GM15006TG-A12 | 人骨髓瘤GM1500 | 6-巰鳥嘌呤 | r1 K | | U-266AR | 人骨髓瘤U-266 | 8-氮鳥嘌呤 | ε λ | 骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細(xì)胞濃度以104～5×105/ml為宜，zui大濃度不得超過106/ml。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長的中期時，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細(xì)胞在傳代過程中，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8-氮鳥嘌呤進行處理，使生存的細(xì)胞對HAT呈均一的敏感性。 ?。?）飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若加入其它活細(xì)胞，則可促進這些細(xì)胞生長繁殖，所加入的這種細(xì)胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。在制備McAb的過程中，許多環(huán)節(jié) 需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的量為一般為2×104或105細(xì)胞/孔。 2．細(xì)胞融合的步驟 ?。?）制備飼養(yǎng)細(xì)胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。 與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周齡 ↓ 拉頸 處死，浸泡在75%酒精內(nèi)，3～5min ↓ 用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜 ↓ 用無菌注射器注入5～6ml預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴(yán)禁刺破腸管） ↓ 反復(fù)沖洗，吸出沖洗液 ↓ 沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5～6min ↓ 用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105/ml ↓ 加入96孔板，100μl/孔 ↓ 放入37。c CO2孵箱培養(yǎng) ?。?）制備免疫脾細(xì)胞 zui后一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死 ↓ 無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗 一次 ↓ 脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng) ↓ 離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次 ↓ 計數(shù) ↓ 取108脾淋巴細(xì)胞懸液備用 ?。?）制備骨髓瘤細(xì)胞 取對數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離心 ↓ 用無血清培養(yǎng)液洗2次 ↓ 計數(shù)，取得×107細(xì)胞備用 ?。?）融合 ?、賹⒐撬枇黾?xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不*培養(yǎng)液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動。 ?、?0s內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。 ?、奂?7。C預(yù)溫的不*培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。 ?、茈x心，800rpm, 6min。 ?、莩渖锨澹煤?0%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。 ⑥將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。 ?、邔⑴囵B(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 （三）選擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測 1．HAT選擇雜交瘤細(xì)胞 脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG處理后，形成多種細(xì)胞的混合體，只有脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義。在HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細(xì)胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以生長繁殖。 在用HAT選擇培養(yǎng)1～2天內(nèi)，將有大量瘤細(xì)胞死亡，3～4天后瘤細(xì)胞消失，雜交細(xì)胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持7～10天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每2～3天換一半培養(yǎng)液。 2．抗體的檢測 檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。 常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測。（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗適合于細(xì)胞表面抗原的McAb的檢測。（4）其它如間接血凝試驗、細(xì)胞毒性試驗、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗等。 （四）雜交瘤的克隆化 雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體的分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開就需要克隆化。克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因為抗體非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。 克隆化的方法很多，zui常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。 1．有限稀釋法克隆 ?。?）克隆前1天制備飼養(yǎng)細(xì)胞層（同細(xì)胞融合）。 2）將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計數(shù)。 ?。?）調(diào)整細(xì)胞為3～10個細(xì)胞/ml。 ?。?）取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細(xì)胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中 。 ?。?）在第7天換液，以后每2～3天換液1次。 ?。?）8～9天可見 細(xì)胞克隆形成，及時檢測抗體活性。 ?。?）將陽性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴大培養(yǎng)。 ?。?）每個克隆應(yīng)盡快凍存。 2．軟瓊脂培養(yǎng)法克隆 ?。?）軟瓊脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。 ?、?%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。 ?、?.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。 ?。?）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養(yǎng)細(xì)胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。 ?。?）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。 （4）1ml 0.5%瓊脂液（42℃預(yù)熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。 （5）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。 ?。?）4～5天 后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔中進行培養(yǎng)。 ?。?）檢測抗體，擴大培養(yǎng)，必要是地再克隆化。 （五）雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 1．雜交瘤細(xì)胞的凍存 及時凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。 雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長滿孔底時，一孔就可以裝一支安瓿凍存。 細(xì)胞凍存液：50%小牛血清；40%不*培養(yǎng)液；10%DMSO（二甲基亞砜）。 凍存液預(yù)冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0℃后放入-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可用細(xì)胞凍存裝置進行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長時間。 2．細(xì)胞復(fù)蘇方法 將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min內(nèi)使凍存的細(xì)胞解凍，將細(xì)胞用*培養(yǎng)液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞形成集落時，檢測抗體活性。 ?。﹩慰寺】贵w的大量生產(chǎn) 大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種： ?。?）體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為10～60μg/ml,如果大量生產(chǎn)，費用較高。 ?。?）體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。 ?、賹嶓w瘤法：對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共2～4點。待腫瘤達(dá)到一定大小后（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達(dá)到1～10mg/ml。但采血量有限。 ?、诟顾闹苽洌撼Ｒ?guī)是先腹腔注射0.5ml Pristane （降植烷）或液體石蠟于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)到5～10mg/ml，這是目前zui常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水塊、量多。 ?。ㄆ撸﹩慰寺】贵w的鑒定 對制備的McAb進行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的，應(yīng)做下述幾個方面的鑒定： 1．抗體特異性的鑒定 除用免疫原（抗原）進行抗體的檢測外，還應(yīng)該用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)該用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。②制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細(xì)胞因子間有無交叉。 2．McAb的Ig類與亞類的鑒定 一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進行篩選時已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴或夾心ELISA來確定。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG（3%），更有利于沉淀線的形成。 3．McAb中和活性的鑒定 用動物或細(xì)胞的保護實驗來確定McAb的生物學(xué)活性。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細(xì)胞，來觀察動物或細(xì)胞是否得到抗體的保護。 4．McAb識別抗原表位的鑒定 用競爭結(jié)合試驗，測相加指數(shù)的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。 5．McAb親合力的鑒定 用ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親合力。 |
